海藻糖在細胞凍存方面的應(yīng)用（3）小鼠睪丸生精細胞凍存

前兩期，我們分享了海藻糖用于人源少突膠質(zhì)前體細胞（OPC）和脂肪來源干細胞凍存的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)向凍存液中添加一定量海藻糖或使用海藻糖+甘油復(fù)合型凍存保護劑，可以提升干細胞長期凍存后的復(fù)蘇活率，從而有助于后續(xù)將干細胞用于疾病治療或創(chuàng)面修復(fù)等臨床應(yīng)用。

本期，我們以小鼠睪丸生精細胞凍存為例，來探究一下海藻糖在輔助生殖領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

不同凍存保護劑對未性成熟小鼠睪丸生精細胞凍存的影響

近些年，隨著輔助生殖技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的患者生育后代成為了可能。在此過程中，生殖相關(guān)細胞的長期凍存成為了影響成功率的關(guān)鍵技術(shù)難點之一。

例如，對于青春期前男性腫瘤患者，性腺毒性治療可能會導(dǎo)致生育能力喪失，睪丸組織或細胞低溫長期凍存是保存其生育力的重要手段。

然而對于全身性腫瘤患者，睪丸組織冷凍及復(fù)蘇后自體移植會帶來再次引入癌細胞的風(fēng)險。考慮到睪丸細胞懸浮液可以進行分選清除癌細胞，而精原干細胞（SSC）可以在體外培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化成圓形精子細胞，通過圓形精子細胞注射獲得后代。

因此，對于青春期前男性腫瘤患者，睪丸生精細胞的長期凍存是保存生育能力的重要途徑之一，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

來自鄭州大學(xué)人民醫(yī)院的張嘯龍等研究人員，采用兩周齡小鼠模擬人在青春期前未性成熟的睪丸發(fā)育狀態(tài)，采用不同凍存方案對小鼠睪丸生精細胞進行低溫凍存，探究最佳冷凍方案。

該研究根據(jù)凍存液組分不同，分為以下5組：

組別

采用兩步酶解法制備小鼠睪丸生精細胞懸液，分裝，分別加入5組凍存保護劑并轉(zhuǎn)移至凍存管中。將凍存管進行程序化冷凍，2個月后從液氮中取出，復(fù)蘇，檢測細胞活率、凋亡率、線粒體膜電位等。

①凍存前后細胞活率及復(fù)蘇率

與凍存前比較，5組實驗組細胞凍存復(fù)蘇后活率均有所下降。其中E組細胞活率及復(fù)蘇率顯著高于其余4組。

②凍存后細胞恢復(fù)情況

以每組4mg睪丸組織解離凍存后實際回收的活細胞數(shù)，對睪丸細胞凍存復(fù)蘇后進行定量計算。結(jié)果顯示E組細胞恢復(fù)數(shù)量顯著高于其他4組。

③細胞凋亡率

流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，各實驗組細胞凋亡率均顯著增加。5組實驗組中，E組細胞凋亡率顯著低于其余4組。

④線粒體膜電位

與對照組相比，凍存復(fù)蘇后5組實驗組細胞線粒體膜電位均顯著下降，其中E組下降程度低，顯著低于其余4組。

冷凍保護劑可分為滲透性保護劑和非滲透性保護劑，非滲透性保護劑中，常用的是蔗糖和海藻糖。此前有研究顯示，向冷凍保護劑中添加蔗糖或海藻糖，可顯著提高恒河猴或小鼠的睪丸細胞復(fù)蘇活率。

該研究結(jié)果顯示，冷凍保護劑中添加0.1mol/L蔗糖或0.1mol/L海藻糖對細胞低溫冷凍均具有一定的保護作用，而同時添加0.1mol/L蔗糖和0.1mol/L海藻糖可顯著提高小鼠睪丸生精細胞冷凍復(fù)蘇后的活率，降低細胞凋亡率，并降低低溫凍存對細胞線粒體膜電位的損傷。

但較高的DMSO濃度（15%）產(chǎn)生的細胞毒性會部分抵消蔗糖和海藻糖的冷凍保護作用。